코헤신의 Sgo1 및 Wapl와의 결합 부위의 식별

SA2는 Scc1과 다양한 상호 작용 영역을 가지고 있었지만, 이러한 상호 작용에서 기능적으로 중요한 아미노산 잔기를 특정하기 위해 다양한 돌연변이를 이용하여 상호작용을 분석했다. 그 결과, 부위 IV에 위치한 SA2의 Asp793에 Lys를 도입한 돌연변이만 Scc1과의 상호 작용을 결손했다. Asp793는 Scc1의 αC과 αD을 잇는 루프에 위치한 Pro376 및 Ala377의 주쇄와 수소 결합을 형성했다. 또한 이 SA2 돌연변이 자매 염색분체의 접착을 저하시킨 것으로부터, SA2-Scc1 복합체의 형성이 코헤신 기능적인 링구조를 구축하는데 중요하다는 것을 보여 주었다. SA2가 Scc1과 결합함으로써 Smc3 및 Smc1의 ATPase 활성을 억제하고 코헤신과 염색질의 결합을 유지시켜 있는지도 모른다.

Thr346의 인산화된 Sgo1는 M기에 중심체 영역의 코헤신과 결합하여 자매 염색분체의 접착을 형성. 그러나 코헤신과 인산화 Sgo1와 물리적으로 상호 작용하고 있는지 여부는 알려지지 않았다. 그래서 인산화 Sgo1와 SA2-Scc1 복합체와 상호작용 영역을 식별했다. SA2-Scc1 복합체와 인산화 Sgo1과의 상호 작용의 분자 메커니즘을 해명하기 위해 결정화 방법등 다양한 결정학적 기법을 이용하여 SA2, Scc1 인산화 Sgo1로 구성된 삼자 복합체의 구조 분석을 시도했지만 구조 분석에 적합한 결정을 얻을 수 없었다. 그러나 시행착오 속에서 결정화 용액에 포함된 부표II에 결합된 구조를 얻는 데 성공했다.

SA2의 Tyr297, Arg298, Tyr331와 수소 결합을 형성하고 있으며, 인산기와 비슷한 모양을하고 있었기 때문에 이러한 잔류 물은 Thy346의 인산화된 Sgo1과 결합하는 수용체 역할을하는 것으로 생각되었다. 실제로 이러한 잔기의 돌연변이는 자매 염색 분체의 접착을 저하시킨 점에서 Sgo1과의 결합 포켓의 형성에 관여하는 것이 시사되었다. 또한 흥미롭게도, SA2의 Tyr297 및 Arg298는 진핵 생물에서 저장된 FVHRYRD 주제에 위치하고 있으며, 코히 신 로더 인 Scc2-Scc4 복합체의 결합 부위이기도하다. FVHRYRD 주제 돌연변이는 in vitro 에서 환상 DNA에 코헤신로드를 부분적으로 저해하고 또한 신진 효모에서 자매 염색 분체의 접착 적자를 일으킨다 고보고되고있다. 그래서 FVHRYRD 주제 돌연변이가 인간에서도 마찬가지로 코헤신로드를 저해 여부 확인했지만, 억제는 일어나지 않았다. Scc2-Scc4 복합물은 SA2를 포함한 여러 코헤신 서브유닛과 상호 작용하기 때문에 인간은 SA2와 Scc2-Scc4 복합체와의 상호 작용을 저해하고도 코헤신 로드가 일어날 것이다. 

Sgo1과 코헤신의 결합을 저해하는 SA2 돌연변이를 이용하여 Wapl과 코헤신과의 상호 작용을 분석했다. 그 결과,이 돌연변이뿐만 아니라 Wapl과 코헤신과 결합 저해를 일으킨. 또한이 돌연변이의 변이 아미노산 잔기가 중심체 영역 및 염색체 팔의 형성에 중요한 것으로부터, Sgo1의 코헤신과의 결합 부위와 Wapl의 코헤신과의 결합 부위와 오버랩하고있다 것으로 밝혀졌다.

중심체 영역에서 자매염색 분체의 접착 형성에 Sgo1의 두 가지 기능

지금까지 Sgo1 기능은 탈 인산화 효소인 PP2A를 중심체 영역의 코헤신에 채용하고 sororin을 Cdk1에 의한 인산화으로부터 보호함으로써 Pds5-sororin 복합체를 안정화시키고 Wapl과 Pds5의 결합을 저해한다는 것이었다. 그래서 Sgo1과 Wapl에게 코헤신의 경쟁적인 상호 작용의 기능을 알아보기 위해 sororin 9A 돌연변이를 이용하여 분석했다. sororin 9A 돌연변이는 Cdk1등에 의해 인산화되지 않는 돌연변이이다. sororin 9A 돌연변이를 발현시킨 세포를 Nocodazole 또는 MG132을 사용하여 각각 이전 중기 또는 중기에서 세포주기를 정지시켰다. 그 결과, 흥미롭게도, 전 중기에서 세포주기를 정지시킨 세포에서 자매 염색 분체의 접착에 변화는 보이지 않았지만, 중기에서 세포주기를 정지시킨 세포에서 자매 염색 분체의 접착이 감소했다. 이것은 이전 중기의 PP2A-Sgo1 복합체에 의한 sororin의 탈 인산화뿐만 자매 염색 분체의 접착을 유지할 수 없는, 즉 중기부터 후기에 걸쳐 Sgo1이 코헤신과 결합 Wapl과 코헤신의 결합을 저해하는 수, 자매 염색 분체의 접착을 형성하는 데 중요한 Sgo1의 제 2 기능임을 뒷받침했다

SA2-Scc1 복합체의 구조 결정, 생화학적인 접근, 세포 생물학적 인 접근 방식 Sgo1이 코헤신과 결합하여 Wapl과 코헤신의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것이 중심체 구조의 형성 에 중요하다는 것을 밝혀졌다. 한편, SA2-Scc1 복합체와 Sgo1 또는 Wapl와 삼자 복합체의 구조 및 그 상호 작용의 분자 메커니즘은 여전히​​ 불분명하다. 또한 Pds5-sororin 복합체 또는 Pds5-Wapl 복합체에 의한 자매 염색 분체의 접착 및 억제 기능, Sgo1 의한 세빠라제 대한 중심체 구조 보호기구의 해명도 향후 중요한 과제이다. 코헤신의 다양한 하위 콤플렉스의 구조 분석 및 전자 현미경 등을 이용한 코헤신 및 제어 단백질과 인타쿠토의 초분자 복합체의 구조 분석 및 상호 작용 분석하여 코헤신 매력적인 링 구조에 의한 염색체 역학 밝혀되어가는 것이다.